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PCR 技术片段拼接的SOE 和SDL 方法

作者:admin 发布日期:2018-09-21 18:20
PCR 技术(多聚酶链式反应)是现代分子生物学的一个巨大突破,它能在体外迅速、大量、灵敏地扩增基因片
段。可是,经PCR 技术扩增的大量相关基因片段如何能有效拼接,却是一个很值行探讨的问题。传统的方法是引入
限制性内切酶位点,这不但操作繁杂,而有时为了构建限性位点还会影响解读三联密码的正确性,SOE 和SDL 法能
巧妙地解决这个问题。
SOE 法
1989 年,Horton 等人提出了SOE 法(Gene splicing by over lap extension),即通过复制时DNA 链的交
错延伸不实现基因拼接。本法可分四步进行。
(1)引物设计:引物a 和d 是常规引物;b 的左半段为常规引物,右半段为基因Ⅱ的引 物序列;c 同理;则b
和c 的部分碱基可互补配对。
(2)基因I、Ⅱ分别扩增,产物相应为片段A、B 和C、D。
(3)两种产物混合,经变性及退火处理,A 链和D 链部分碱基互补配对,成杂交链。
(4)在DNApolymeraseI 作用下,A 和D 链互为引物和模板,合成出A'D'链,即为基因I 和基因Ⅱ的接接产
物。若在引物中引入突变的碱基序列,则在接接产物中,将按预先 设计要求出现定点突变。
SDL 法
1991 年下半年,Lebedenko 等人提出SDL 方法(Gene splicing by directed ligation),即直接拼接法,它
在SOE 法基础上又有新的突破。本法的要点如下:
(1)限制性内切酶,EcoRI 核酸内切酶(或其它Ⅱs 类限制性内切酶)能专一性识别 6bp 的非回文序列,并能
单向特异性地切断EcoRI 识别的6bp 以外的1—5 个核苷酸,产生一个以突出的4 个核苷酸为结尾的5'末端。因而
该伸头末端与酶切位点序列无关,而是由切点附近的序列决定的。
(2)扩增时实际运用的引物的构建。以exon5 的实用引物为例:5'链引物包括常规5' 链引物序列和BamHI
识别位点及起密码序列;3'链引物包括常规3'链引物和AC 及EcoRI 识别位点。
(3)唯一性末端的形成。经扩增和限制性内切酶处理后可得供拼接的exon5,它的右侧突出末端TCAC 中,
TC 为原始exon5 的一部分,AC 为原始exon6 的一部分,且TCAC 与 exon6 的AGTG 互补配对,其余类推。因
为这种结尾相同的几率为1/259,故可被视作 “唯一性末端”。
(4)把经扩增的exon5、exon6 和exon7 混合,依据碱基互补配对原则,它们就能按顺 序依次拼接。
显而易见,在SOE 法中,退火时的最希望产物是AD,杂交链,但A 链和B 链,C 链和D 链配对的可能性更大,
另外还有B、C 链的配对,这些都是不利的;而SDL 法中就不存在这个问题。另一方面,由于不需DNApolymeraseI,
避免了它在复制中可能带来的错误,所以,SDL 法更优越。
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