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大肠杆菌菌落 PCR

作者:admin 发布日期:2018-09-21 18:15
1.取适量PCR 薄壁管,置于冰上,每管先加入17.3ul 的灭菌水。
2.用灭过菌的10ul 小枪头挑取单克隆白斑至灭菌水中,振荡混匀。
3.依次加入:
10xBuffer   2.5
MgCl2(25mM)   1.8
DNTP(2.5mM)   1
T3 引物(10pmol)   1
T7 引物(10pmol)   1
Taq酶   0.4
Total   25ul
各试剂均加好后,离心机上甩一下,使之沉底,置于PCR 仪上
4. 94℃ 2 min
      94℃ 4 min
      94℃ 40 s
      53.6℃ 40 s,35 个循环
      72℃ 4 min
      72℃ 10 min
      4℃ 24 h
5.待PCR 反应进入4℃后,取下PCR 薄壁管,取7ulPCR 产物加入3ul 溴芬兰跑电泳,同时上1Kb DNA ladder。
半小时后照相,观察胶图,根据胶图粗略鉴定插入片段的大小及小片段率。
6.将快速鉴定和菌落PCR 检测合格的文库送检。完全不必要额外煮沸。只需要挑取少许克隆,在配好的PCR 反应
液中涮几下,然后用正常的PCR 反应程序即可。因为在PCR 第一个循环94°变性的步骤中(正常设置为4-5min 即
可),质粒或基因组肯定有释放,也足够PCR 反应的模板用量了,这个我每天都在做,还没有做不出的时候。
只需要挑取少许克隆,在配好的PCR 反应液中涮几下,然后用正常的PCR 反应程序即可。因为在PCR 第一个
循环94°C 变性的步骤中(正常设置为4-5min 即可),质粒或基因组肯定有释放,也足够PCR 反应的模板用量了,
这个我每天都在做,还没有做不出的时候。
 
补充几点如下:
1. 沾有菌落的牙签在PCR 反应液中涮过之后,还可以直接扔到LB 培养基中用来接种(问题不大,重组质粒一般都
含抗性的)。
2. 在做菌落PCR 的时候,每次都要做阴性、阳性对照,阳性对照可以用抽提好的质粒或基因组,这样可以确定PCR
主反应液的配制没有问题,不会因为菌落PCR 阴性而怀疑PCR 的反应;阴性对照加一点水或者什么都不加,这样可
以帮助识别PCR 反应是否有假阳性产生的可能;如果偷懒的话,阴性对照可以不做,但阳性对照则是必须要做的。
3. 再告诉大家一个偷懒的菌落PCR 鉴定的方法:按照每次反应15-20 ul 的体系计算好PCR 各反应组分的量/次,
然后一次性配制100 次或50 次反应的量,做成Ready-to-use 的PCR 主反应液(除Primers、Taq 酶不加,模板
用的是菌落),每次做菌落PCR 的时候,只需要根据反应的个数,吸取相应的PCR 主反应液,补加相应的Primers、
Taq 酶,再分装即可。这样的好处有二:即开即用,节省时间;另外反应组分均一,可减少实验批次之间的误差。
用枪头挑取半个菌落,加入MIX(除了模板其他的都有),平板放入培养箱继续培养。等PCR 结果出来了,直接
挑取阳性克隆摇菌。
还可以采用菌落裂解电泳的方法直接挑取重组子。一般目的片段如果不是很小,空载体和重组载体比较容易区分的
话,都可以采用这种方法。 将菌落培养时间稍微延长,挑取半个菌落加入裂解液中,同时挑取蓝斑(如非兰白斑,
直接取空载体质粒)作为对照,电泳即可区分。 这个方法有现成的试剂盒,也可以自己配制。
菌落PCR:我的做法是用枪头挑菌落,在分装好的pcr 反应体系(除了Taq 酶)中吸几下,然后在100 度5 分钟裂
解后加入Taq 酶,然后就可以进行pcr 循环了。
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