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pfu 特性FAQ

作者:admin 发布日期:2018-09-21 17:51
1.加入Pfu 酶之前将PCR 所需要的所有成分全部加齐后轻弹管底然后离心,然后加入Pfu 酶,但是此时不能象
加入Taq 酶一样轻弾管底而是直接离心,放入PCR 仪器中,效果比较好,但是原理不是很理解。
2.退火时间要延长一般,预延伸时间4 分半钟,而延伸时间要15 min,这和Pfu 酶很低的延伸活性有很大的关
系,增加延伸的时间是很有必要的.
1、Pfu DNA 聚合酶的精确度如何?
因为具有3´--5´外切酶(校对)活性,Pfu DNA 聚合酶是现今所描述过的所有热稳定酶中精确度最高的一种。
普洛麦格公司的Pfu DNA 聚合酶的出错率大约是1×10-6/每碱基对,而Taq DNA 聚合酶的出错率大约是1×10-5/
每碱基对。普洛麦格公司推荐将Pfu DNA 聚合酶使用在那些需要高精确度的PCR 应用中,包括克隆、基因表达和
突变分析。
2、Pfu DNA 聚合酶产生平未端PCR 片断吗?
因为天然的校对活性,Pfu DNA 聚合酶产生的PCR 片断是平末端的。收集到的有关Pfu DNA 聚合酶的数据表
明90%的PCR 产物是平末端的。这种特性极大地提高了平末端连接的效率。
3、Pfu DNA 聚合酶产生的PCR 产物怎样才能被克隆到普洛麦格的T-载体上?
平未端DNA 片断在经过修饰后,也就是在dATP 存在的情况下,使平未端片段与Taq DNA 聚合酶共同保温,
就能促进其被克隆进T-载体。普洛麦格公司的pGEM®-T 和pGEM®-T easy 技术手册(TM042)中有讲述尾端加
A 的操作程序。
4、Pfu DNA 聚合酶的PCR 反应条件与常规PCR 反应条件有什么不同?
为了减少由3´-5´外切酶活性引起的引物降解,普洛麦格强烈推荐在冰浴上添加所有试剂并且在温度达到60-65
°C 时加入Pfu DNA 聚合酶以便进行热启动或者在冰浴上添加试剂后放在预热到95°C 的PCR 仪上。
Pfu DNA 聚合酶比Taq DNA 聚合酶的延伸反应速率低。因此我们推荐的扩增延伸反应时间为每kb 需2 分钟,
而Pfu DNA 聚合酶仅需要1 分钟。
普洛麦格公司为Pfu DNA 聚合酶提供10X 反应缓冲液,其中包括20mM MgSO4。此酶在MgSO4 中活性最
佳,而最佳的镁浓度是2 mM。
5、Pfu DNA 聚合酶怎样影响PCR 引物设计?
由于校对活性而具有的高精确度可引起引物从3´端被降解。在设计引物时这个降解速率应考虑进去。最初的15
个5´碱基应该具有几乎不被降解的能力。这样,用于Pfu DNA 聚合酶反应的良好的引物长度应是20-30 碱基。另
一个防止引物被降解的办法是在合成引物中引进一个磷酸化(phosphorothioate-coupled)的碱基。
6、Pfu DNA 聚合酶怎样与其它热稳定酶相比?
Pfu DNA 聚合酶和其它几种常用的DNA 聚合酶的性质列在表1 中,某一个酶在某个特定的应用中也许比其它
的酶更有用。当选用酶时,请参考表2 和表3。

表1:普洛麦格几种热稳定酶的性质

表2:普洛麦格公司热稳定酶的功能比较

• 准确度 指在一个错误的碱基被合成前已合成的碱基数目
• 特异性 在PCR 中指排除错误引物配对,引物二聚体,或其它在低温下可发生的反应的能力
 
表3:PCR 应用的比较

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